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近年來(lái)，現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)（point of care test, POCT）已成為熱門(mén)研究領(lǐng)域。POCT檢測(cè)儀器操作簡(jiǎn)單、體積小巧、便于攜帶，廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷。熒光免疫層析分析是利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體后，結(jié)合免疫層析試紙上的抗原抗體的特異性反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析的技術(shù)。

近年來(lái)，生物技術(shù)發(fā)展迅速，熒光免疫層析分析技術(shù)也從專業(yè)醫(yī)療場(chǎng)所檢測(cè)，發(fā)展到基層社區(qū)檢測(cè)。因此，設(shè)計(jì)一款人機(jī)交互友好、價(jià)格低廉、方便攜帶的熒光免疫層析定量檢測(cè)裝置具有重要的研究意義。

1 研究現(xiàn)狀

熒光免疫定量分析方法可以分為光電掃描法和圖像分析法等。光電掃描法采用步進(jìn)電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)光電接收器件掃描熒光試條，通過(guò)分析光電接收器件輸出的模擬電信號(hào)變化規(guī)律進(jìn)行定量檢測(cè)。目前常見(jiàn)的熒光免疫定量分析儀大多以光電掃描方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，如：Lateral Flow（德國(guó)Qiagen公司）、i-CHROMATM Reader（韓國(guó)）、飛測(cè)Ⅲ（廣州萬(wàn)孚）等免疫熒光分析儀。雖然這些儀器具有較高的精度和穩(wěn)定性，但因體積較大、使用和維護(hù)成本較高，難以在基層和家庭普及使用。

圖像分析法通過(guò)電荷耦合器件（charge coupled device, CCD）或者互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（com- plementary metal-oxide-semiconductor, CMOS）傳感器采集試條圖像，并采用圖像分割、處理等技術(shù)提取特征值。由于減少了掃描電機(jī)和模擬信號(hào)處理電路，且軟件可在線升級(jí)，后期校準(zhǔn)操作簡(jiǎn)單，因此與光電法相比較，圖像分析法的檢測(cè)裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、檢測(cè)信息更加豐富，是實(shí)現(xiàn)便攜式免疫層析試條裝置的最有效手段。

本文利用現(xiàn)有智能手機(jī)作為終端設(shè)備，設(shè)計(jì)出具有激發(fā)光源的測(cè)試暗盒，形成一款易于操作、便于推廣的熒光免疫層析定量檢測(cè)裝置。

2 熒光免疫定量檢測(cè)裝置設(shè)計(jì)

本文設(shè)計(jì)的熒光免疫定量檢測(cè)裝置，主要由Android智能手機(jī)和熒光測(cè)試暗盒構(gòu)成，如圖1所示。制作時(shí)，選用魅藍(lán)E智能手機(jī)作為載體，通過(guò)編寫(xiě)手機(jī)App實(shí)現(xiàn)人機(jī)交互功能，調(diào)用手機(jī)的主攝像頭采集熒光試條圖像，借助手機(jī)的運(yùn)算核心進(jìn)行圖像分析。3D打印熒光暗盒由上下兩個(gè)部分組成，上半部分設(shè)計(jì)手機(jī)固定結(jié)構(gòu)，并裝配LED、微距鏡、濾鏡、電池等器件；下半部分包括熒光試條固定卡槽、裝配定位銷等結(jié)構(gòu)。熒光測(cè)試暗盒結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖1 熒光免疫層析試條檢測(cè)裝置結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 熒光免疫層析試條檢測(cè)裝置暗盒結(jié)構(gòu)圖

為了提高試條圖像數(shù)據(jù)的一致性，系統(tǒng)應(yīng)消除外界光線的干擾，整個(gè)光路盡可能空間密閉[11]。采集圖像時(shí)所需要的照明光線，由340nm波長(zhǎng)的激發(fā)光源提供。取景口加裝微距鏡，將暗盒高度從7cm縮小到3.5cm；微距鏡前添加中心波長(zhǎng)610nm的濾光鏡，減小其他波長(zhǎng)的光線對(duì)熒光的影響；熒光暗盒內(nèi)部部分區(qū)域貼上漫反射片，延長(zhǎng)光路并增大LED照射范圍。

2.1 Android軟件設(shè)計(jì)

本文設(shè)計(jì)的檢測(cè)裝置軟件，基于Android Studio平臺(tái)開(kāi)發(fā)，同時(shí)借助OpenCV計(jì)算機(jī)視覺(jué)庫(kù)、LitePal開(kāi)源Android數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行圖像分析及數(shù)據(jù)處理。以高精度、高效率、友好的人機(jī)交互體驗(yàn)為目標(biāo)，提高不同Android版本、終端設(shè)備間的兼容性，為后期的大面積推廣應(yīng)用做準(zhǔn)備。

軟件流程如圖3所示，圖中圖像處理環(huán)節(jié)：調(diào)用截圖函數(shù)對(duì)試條圖像進(jìn)行剪切，以獲得試條觀察窗部分的圖像；再使用OpenCV計(jì)算機(jī)視覺(jué)庫(kù)的降噪函數(shù)進(jìn)行圖像降噪處理。

人機(jī)交互流程如圖4所示，整個(gè)程序以主頁(yè)面為中心樞紐，首頁(yè)可跳轉(zhuǎn)至歷史記錄顯示頁(yè)面，方便用戶查詢數(shù)據(jù)，同時(shí)也支持觸發(fā)程序主頁(yè)面。主頁(yè)面內(nèi)包含程序的主要功能，按需跳轉(zhuǎn)至不同的功能頁(yè)面。為支持對(duì)前期采集的試條圖像進(jìn)行計(jì)算，采集按鈕設(shè)計(jì)成觸發(fā)相冊(cè)頁(yè)面。采集新圖像時(shí)，點(diǎn)擊相冊(cè)內(nèi)置的拍照按鈕，程序轉(zhuǎn)至拍照頁(yè)面。

圖3 熒光免疫層析試條檢測(cè)軟件流程圖

圖4 人機(jī)交互流程

2.2 T線、C線圖像分割及特征值提取

對(duì)試條圖像進(jìn)行觀察、比較過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)試條做工比較精細(xì)；質(zhì)控線（control line, C線）、測(cè)試線（test line, T線）垂直方向上熒光物質(zhì)分布均勻，形狀為矩形；不同批次的試紙條T線、C線位置基本一致；試條觀察窗背景顏色單一，與目標(biāo)圖形差異主要體現(xiàn)在灰度值上。熒光暗盒上設(shè)計(jì)的試條、手機(jī)固定裝置，結(jié)實(shí)牢靠且匹配精度高。

基于軟件圖像處理、分析的靈活性考慮，本文采用固定窗口預(yù)截圖后，計(jì)算、比較滑動(dòng)窗口覆蓋區(qū)域的灰度值，實(shí)現(xiàn)T線、C線的圖像探測(cè)與分割。該方法既有效地提取圖像中的目標(biāo)區(qū)域，又節(jié)約系統(tǒng)的運(yùn)算資源，提高軟件運(yùn)行速度。

滑動(dòng)窗口運(yùn)動(dòng)方式如圖5所示，黑色矩形代表左邊滑動(dòng)窗口，灰色矩形代表右邊滑動(dòng)窗口，以橫坐標(biāo)X中點(diǎn)為界把圖像分為左右兩個(gè)部分，兩個(gè)滑動(dòng)窗口在各自的區(qū)域內(nèi)，以一個(gè)像素點(diǎn)為步長(zhǎng)水平移動(dòng)。每移動(dòng)一次，計(jì)算出當(dāng)前覆蓋像素的灰度值總和，經(jīng)過(guò)比較算出左右區(qū)域的最大值。

在雙抗夾心熒光免疫層析試條定量分析時(shí)，可用T線、C線像素灰度值的比值作為特征值。熒光標(biāo)記物在層析的過(guò)程中，少量殘留于試條背景區(qū)域上，在設(shè)定特征值時(shí)應(yīng)考慮背景區(qū)域的影響。令左邊滑動(dòng)窗口當(dāng)前覆蓋區(qū)域的灰度值總和為Hx，最大值為HC；右邊滑動(dòng)窗口當(dāng)前覆蓋區(qū)域的灰度值總和為Hy，最大值為HT；特征值

公式（1）

圖5 滑動(dòng)窗口運(yùn)動(dòng)方式

2.3 標(biāo)準(zhǔn)試條圖像測(cè)試

為了驗(yàn)證軟件設(shè)計(jì)的圖像分割、特征值提取算法，本文使用標(biāo)準(zhǔn)熒光試條圖片，對(duì)檢測(cè)裝置進(jìn)行測(cè)試。

圖6 熒光試條標(biāo)準(zhǔn)圖像

由于軟件算法設(shè)計(jì)合理，實(shí)際計(jì)算過(guò)程中耗時(shí)少。圖7列出1號(hào)至12號(hào)試條識(shí)別的結(jié)果，左邊的矩形框內(nèi)為C線，右邊矩形框內(nèi)為T(mén)線。

圖7 試條T線、C線檢測(cè)及分割結(jié)果

由圖7可知，軟件在標(biāo)準(zhǔn)試條圖像測(cè)試中，準(zhǔn)確識(shí)別出各試條的T線和C線。當(dāng)試條上的熒光物質(zhì)較多時(shí)，攝像頭采集到的測(cè)試線、質(zhì)控線圖像出現(xiàn)光暈。實(shí)測(cè)試條T線和C線寬度約為60個(gè)像素點(diǎn)，滑動(dòng)窗口寬度越接近T線、C線的實(shí)際寬度時(shí)，計(jì)算結(jié)果越準(zhǔn)確。

但是滑動(dòng)窗口越寬，數(shù)據(jù)量越大，增加軟件計(jì)算時(shí)間。假設(shè)T線、C線熒光物質(zhì)橫向富集特性相似，通過(guò)適當(dāng)縮小滑動(dòng)窗口寬度，提高軟件計(jì)算效率。本文滑動(dòng)窗口寬度取10～70像素點(diǎn)，每次遞增10點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，特征值t的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同寬度滑動(dòng)窗口計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)試條特征值結(jié)果

表1中數(shù)據(jù)顯示，隨著滑動(dòng)窗口寬度逐漸增大，同一試條的特征值呈緩慢減小趨勢(shì)。

由圖8得出，軟件計(jì)算出來(lái)的試條圖像特征值，隨圖像T線的灰度值降低而單調(diào)遞減；同時(shí)取滑動(dòng)窗口寬度50像素點(diǎn)計(jì)算結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，特征值整體變化趨勢(shì)一致，線性擬合時(shí)R2＞0.96。說(shuō)明滑動(dòng)窗口分割法在標(biāo)準(zhǔn)試條圖像分析、計(jì)算中，有效提取圖像的特征值。

圖8 特征值t分布圖

在測(cè)試過(guò)程中，二次安裝試條時(shí)，T線、C線可能發(fā)生位移。另外由于試條卡槽橫截面梯形設(shè)計(jì)，試條前、后、上、下可移動(dòng)的范圍非常小?，F(xiàn)把試條分別左、右移動(dòng)25像素點(diǎn)、50像素點(diǎn)，上、下移動(dòng)5像素點(diǎn)進(jìn)行模擬測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，試條左、右移動(dòng)時(shí)，除了12號(hào)試條右移50像素點(diǎn)時(shí)，特征值增大0.001，其他試條計(jì)算結(jié)果保持不變；試條上、下移動(dòng)時(shí)，特征值變化在0～0.002范圍內(nèi)，不影響檢測(cè)裝置定量分析。

表2 左右移動(dòng)試條特征值計(jì)算結(jié)果

程序響應(yīng)時(shí)間也是檢測(cè)裝置性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，表3列出試條計(jì)算時(shí)間，結(jié)果顯示計(jì)算耗時(shí)分布比較隨機(jī)，大致落在260～310ms區(qū)間內(nèi)，程序算法效率較高。

表3 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)試條特征值耗時(shí)

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)了基于Android平臺(tái)的熒光免疫層析試條檢測(cè)裝置，編寫(xiě)了Android智能手機(jī)定量分析App，提出了滑動(dòng)窗口圖像分割算法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，系統(tǒng)準(zhǔn)確定位試條T線和C線，特征值隨熒光強(qiáng)度降低單調(diào)遞減，試條T線和C線熒光物質(zhì)縱向上分布、橫向分布趨勢(shì)一致，縮小滑動(dòng)窗口寬度對(duì)特征值計(jì)算結(jié)果影響微小。本文研制的檢測(cè)裝置經(jīng)校準(zhǔn)后，適用于熒光免疫層析試條定量分析。

由于受實(shí)驗(yàn)條件、制作工藝、軟硬件開(kāi)發(fā)水平等因素影響，該檢測(cè)裝置研制完成后，還存在一些不足之處，有待日后進(jìn)一步完善：

1）用真實(shí)試條對(duì)檢測(cè)裝置進(jìn)行校準(zhǔn)。

2）兼容多種熒光免疫層析試條。各試條廠商生產(chǎn)的熒光免疫層析試條尺寸大小不一，本文設(shè)計(jì)的試條卡槽的尺寸參數(shù)固定，后期可增加彈片、偏心螺母等調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)設(shè)計(jì)，對(duì)不同尺寸的試條進(jìn)行匹配。

以上研究成果發(fā)表在2020年第4期《電氣技術(shù)》雜志，論文標(biāo)題為“基于Android平臺(tái)便攜式熒光免疫層析試條檢測(cè)裝置的設(shè)計(jì)”，作者為鄭齊、吳輝煌、高躍明。